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荧光分子成像技术与荧光材料介绍
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时间:2012-04-09 16:16:52

  分子影像学(荧光成像)是近几年在已有的医学影像技术基础上发展起来的一门新学科,广义上是指在细胞和分子水平对生物体进行在体成像。传统的医学影像技术是以生物体本身的物理特性或者生理特性作为成像源进行的诊断显像,这些物理量或者生理量对与疾病或生理功能相关的分子或细胞没有特异性;而分子影像技术则是以这些特定的分子或细胞作为成像源,对生物体内分子水平的变化进行在体成像,获得它们生物体内部实际的分布图像。因此,分子影像技术有助于早期的诊断疾病、促进药物研制和分析生命机理。

  根据成像的原理不同,可将分子影像学的成像技术分为核医学、光学和磁共振(MRI)等分子成像技术。核医学分子成像主要包括PET和SPECT,它们对体分子荧光的产生与某些具有特殊光学特性的荧光内的放射性核素产生的γ射线进行成像,穿透度深,灵敏度高,但放射性源可引起电离辐射,长期对人体有害。在光学分子成像中,荧光分子成像利用了具有特异性的荧光分子探针标记特定分子或细胞,空间分辨率能达到m m级,其探针是生物学和医学研究中已大量使用的荧光标记物,为生命科学工作者所熟知,在体外成像中已大量应用,很受科学研究人员的欢迎,且具有灵敏度较高、时间分辨率高、快捷简便、费用低、相对高通量等诸多优点[5],因而近几年发展迅猛。荧光分子成像由于穿透距离短,目前主要用于小动物成像。

  物质吸收和释放能量有关。当一个分子或者原子吸收了给予的能量后,从一种电子态向另一种能量较低的电子态弛豫引起发光,停止能量供给时发光亦瞬间停止,这样的发光叫做荧光。具体而言,荧光的产生过程是指荧光分子或者原子吸收能量后跃迁到激发态,通过非辐射内转化等方式转移到激发态的最低能级,短暂停留后发出荧光并回到基态。

  荧光分子探针(荧光成像)

  在荧光分子成像中,为了对感兴趣的生物分子过程进行辨别,需要借助于荧光分子探针进行观察和定量分析。荧光分子探针按照其成像过程的不同可以分为直接成像型荧光分子探针和间接成像型荧光分子探针。直接成像型荧光分子探针分为活性分子探针和激活型分子探针,都是经过工程处理后可以直接作用于受体或某种特定的酶。其中活性分子探针在没到达靶向目标时也会发出荧光,在检测的过程中背景噪声比较大,扫描器很难将源示踪剂从边界及代谢示踪剂中区分出来,源示踪剂的消失也需要一段时间。为了克服这个缺点,一种被称之为“智能探针”的具有特异性分子成像的激活型分子探针应运而生,不仅可以用于光学成像设备,也可用于核磁共振成像设备中。此类探针只有在靶向目标时才“打开”,因而提高了信噪比。如近红外荧光探针,能被基质金属蛋白酶激活,荧光团在一定的条件下可从载体中释放出来并发出明亮的荧光。间接成像型荧光分子探针是指在间接成像中某些转基因表达的荧光蛋白,它在阐明基因的表达和调控中发挥着很重要的作用。用光学成像法能检测到转基因转录后的产物荧光蛋白,通过对荧光蛋白的可视化和量化就间接地实现了对基因表达的成像。

  荧光素酶

  荧光素酶(Luciferase)是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。自然界有许多发光生物,1956年,MeElroy等首次从萤火虫中提取到荧光素酶,此后各国研究人员相继报道了对各种发光生物中荧光素酶的研究。由于荧光素酶检测简便、灵敏、快速,因此目前荧光素酶基因在基因工程方面已成为广泛使用的报告基因, 同时荧光素酶在发光免疫分析及环境监测、微生物检测等方面的应用正愈来愈受到关注。

  1. 荧光素酶的种类(荧光成像)

  自然界中具有发光能力的生物种类很多, 常见的主要有: 发光蘑菇(Luminous mushrooms)、发光蚯蚓(Luminous ehwoi-/ns、发光细菌(tullOllS bacteria)、发光水母 (Luminous idlyflsh)、发光甲虫(Luminous beeries,它们主要由萤火虫(tireflies), 叩头虫 (dick beeries)和欧洲萤(glow worms)3大种类组成)。目前,除发光蘑菇和发光蚯蚓的发光机理尚不清楚外,其余生物的发光机理已研究得较为透彻,并使细菌荧光隶酶 (Bacterial Lucife 简称BL) 和萤火虫荧光素酶(Firefly Lucife 简称FL)形成商品酶 用于分析检测。 北美萤火虫(Photinus pyralis), 日本萤火虫(Luciola cruciata)及东欧萤火虫(L.mingrelica)可产生FL。夏威夷弧菌(Vibrio harveyi)、费氏弧菌(V.fischeri)、明亮发光杆菌(Photobacteriumphosphoreum) 及鳆发光杆菌(P.1eiognathi)等海洋发光细菌¨ 和发光致病杆菌(Xenorhabdus luminescett)、羽田希瓦氏菌(Alteromonas hanedai)等陆生发光细菌 可产生BL。

  2 荧光素酶的性质和结构

  2.1 萤火虫荧光素酶的性质和结构FL在Mg2+ 、ATP、02存在时,催化D-荧光素(D.

  Lueiferin)氧化脱羧, 同时发出可见光,不同种之间发射波长略有不同(550~580nm).其反应式为:

  萤光素 + ATP → 萤光素化腺苷酸(luciferyl adenylate)+ PPi

  萤光素化腺苷酸 + O2 → 氧荧光素 + AMP + 光

  Lueiferin+ATP+O2(荧光成像)

  FL的分子量约60~64kD,从日本萤火虫(L.cruciata) 中提取的FL含548个氨基酸,分子量约61kD ;北美萤火虫(P.pyralis) 的FL则含550个氨基酸,分子量约62kD;东欧萤火虫(L.mingrelica) 的FL与日本萤火虫FL相似。日本萤火虫FL与北美萤火虫FL氨基酸序列67% 同源。有研究表明,FL的N端16个氨基酸与催化活性密切相关。

  FL是蛋白质和脂类复合物(磷脂和中性脂质与FL结合),在去氧胆酸钠中能使酶活性迅速减弱,Mg2+与FL结合能提高酶的活性;磷酸脂是特定的酶激活剂,能稳定FL,不致失活,而长链胆碱衍生物(C12~C18 ) 能使FL快速、不可逆地失活;牛血清白蛋白、氨基乙醇、CoA能显著提高FL的活性,并促进光的产生。随着反应体系pH的降低,产生的光波长增加;如果各种反应底物成过量状态,则发射光强度与反应体系中FL的量成正比。

  2.2 细菌荧光素酶的性质和结构

  BL催化长链脂肪醛、FMNH2和02的氧化反应,发出绿蓝光(λ=49Onm), BL是杂二聚体, 含α、β两个多肽亚基的加单氧酶。单独α、β亚基均无发光活性,只有α、β 13共存时才有活性。从不同海洋细菌中提取到的BL其分子量基本相同,其中a.亚基含354个氨基酸,分子量约40kD,β-亚基含325个氨基酸, 分子量约37kD。从陆生细菌中分离到的BL的α-亚基含360个氨基酸.分子量约41kD,β-亚基吉327个氨基酸,分子量约38kD,其中陆生细菌的α-亚基和β-亚基氨基酸序列分别有85%和60%与海洋细菌同源。有研究表明,BL与黄素(Flavin)结合点在α-亚基;通过基因重组及定位点诱变发现α-亚基控制酶的催化能力和结构特点,亦是评判酶的热稳定性的关键因素;α-113位对酶与黄素的相互作用密切相关,α-227位在调整酶与底物醛的作用中处于中心位置。(荧光成像)

  和其它酶一样,BL活性受许多因素的影响:O2和离子浓度均能影响发光,乙醛及长链烷基化合物在反应中刺激发光。从发光致病杆菌(x. 1uminescer~) 中提取的BL发现,酶与FMN和豆蔻酸(十四烷酸)形成三元络合物,三元络合物的幔分解限制了酶的转换,脂肪酸能促进酶与FMN的相互作用。研究热稳定性发现,BL的热稳定性与其所表达的有机体有关,但与有机体细胞的抗热性无关,术糖醇 甘油加^培养基中保护酶的活性。N.乙基顺丁烯二酰亚胺对BL失活的影响与pH 有关.随缓冲溶液浓度的增大,失活率升高。

  3. 荧光素酶的应用

  3.1 快速检测ATP既是FL催化发光的必需底物,又是所有生物生命活动的能量来源,传统的测定方法操作复杂,灵敏度低,缺乏足够的专一性。在丌J催化的发光反应中,ATP在一定的浓度范围内,其浓度与发光强度呈线形关系,因此,测定ATP具有快速灵敏的特点, 自1947年McELroy等首次应用丌J测定A11P以来,荧光素酶在生物化学及生物技术的分析应用不断发展,其检测和研究范围包括:临床医学及法医学检测;生命科学研究;环境监测和制备广谱酶联免疫检测试剂。利用BL催化的发光特性可用来检测特异性细菌如大肠杆菌、李斯特菌等,其原理是带有BL基因Lux的噬菌体攻击特异性细菌,将Lux带人宿主细胞,荧光发射只出现在被噬菌体感染的细胞,并与之数量相对应, 利用这种方法检测污染食品中的李斯特菌可从传统的分离、培养、鉴定至少96b缩短至24h,甚至将检测限降至1 cell/g,该方法简单、快速、灵敏,容易掌握。(荧光成像)

  3.2 报告基因分析早在1988年就有报道在分子生物学中应用荧光素酶基因作报告基因” 。通过测定荧光素酶基因的表达,监测各种启动子(promoter)的活性;利用荧光素酶基因与特定目的基因的连锁或共转移,可以建立非放射性的外源基因检测体系。

  目前,这一技术在全世界得到了广泛应用,现代检测仪器甚至可以检测到0一 mol的酶量, 比检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)灵敏100—1OO0倍。由于荧光素酶酶活检测比CAT检测快速、方便、灵敏、经济,而且可以进行活细胞直接检测, 因此在分子生物学研究中可用荧光素酶表达检测代替CAT检测。

  3.3 有毒有害物质分析1994年,Zomer等报道了应用荧光素酶催化的生物发光现象进行水、土壤、食品等样品中有机磷和氨基甲酸酯等杀虫剂的灵敏检测LI4]。其原理是昆虫脑提取物中有杀虫剂攻击的受体或酶结合位点,将生物发光的底物— — D.Lucifefin衍生物渗透至昆虫脑提取物中,昆虫脑提取物能将D—Lacifefin衍生物水解为D.Imcifefin, 添加ATP和FL,即可发生生物发光,而杀虫剂能抑制这种水解活性,通过检测发光强度,即可计算杀虫剂的浓度,灵敏度可达5OraL。(荧光成像)

  标记抗体的荧光素

  人们对生物发光的研究由来已久,通过基因重组及细胞融合技术, 获得能满足各种用途的酶,如定位点诱变提高其耐热性, 改变发射光波长等 由于荧光素酶来源有限,价格昂贵,同时在溶液中是不稳定的,使它的应用受到很大限制,为了降低分析测试成本,扩大其应用范围,实现测定的自动化、连续化,Deluca’s等在1976年首次成功的用化学方法固定化FL和BL, 以后相继有多人采用了多种固定化方法,最近lJ1n—dovskikh,I.A.等应用BrCN活化的Sepharose固定化重组的FL,使检测更稳定,ATP检测范围为0 0l~10,000ntool/L水平 。随者固定化膜技术及生物传感器的发展,荧光素酶的应用范围将更宽广。

  荧光素是具有光致荧光特性的染料,荧光染料种类很多,目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种。

  1.异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末,易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体,其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4,最大吸收光波长为490~495nm,最大发射光波长为520~530nm,呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年,是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感,通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 (荧光成像)

  2.四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200) RB200为橘红色粉末,不溶于水,易溶于酒精和丙酮,性质稳定,可长期保存。最大吸收光波长为 570nm,最大发射光波长为595~600nm,呈现橘红色荧光。

  3.四甲基异硫氰酸罗丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC) TRITC为罗丹明的衍生物,呈紫红色粉末,较稳定。最大吸收光波长为 550nm,最大发射光波长为620nm,呈现橙红色荧光,与FITC的翠绿色荧光对比鲜明,可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢,也可用于单独标记染色。

  4.酶作用后产生荧光的物质 某些化合物本身无荧光效应,一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如,4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮,后者可发出荧光,激发光波长为360nm,发射光波长为450nm。其他如碱性磷酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。 5.镧系螯合物 某些3价稀土镧系元素如铕 (Eu3+)、铽 (Tb3+) 等的螯合物可发射特征性的荧光(荧光成像),而且激发光波长范围宽、发射光波长范围窄、荧光衰变时间长,最适合于时间分辨荧光免疫测定。

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