理论知识
荧光蛋白标记的肿瘤可视化研究新进展
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时间:2012-10-09 15:33:07

     活体体内光学成像主要采用生物发光与荧光成像技术,生物发光技术是利用萤光素酶基因为报告基因,将其转染至靶细胞或靶器官,观察时加入外源性底物荧光素,在荧光素酶的催化下产生发生氧化反应,转变为可见光能释放,再利用活体生物光学成像系统检测;而荧光技术是采用荧光报告基团标记细胞,之后利用激发光使荧光基团达到较高的能量水平, 然后发射出较长波长的光,最后通过活体荧光成像系统检测。与生物发光技术相比,荧光成像技术具有标记靶点的多样性、一次可以应用不同的荧光基因标记不同的细胞的优势,因而在分子生物学研究和观察小分子体内代谢( 如肿瘤细胞、免疫相关细胞等) 等方面已经广泛应用于生物医学领域。目前常用的荧光基团以绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)为代表,无需底物即可自发荧光,对细胞几无毒性。荧光标记细胞可用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜和流式细胞仪等观察,观察的标本包括冰冻切片、细胞悬液滴片、细胞涂片和体外培养细胞等。

  当前将荧光蛋白引入靶细胞或者转基因动物体内,通过活体荧光成像系统在体的、非侵入的、动态地观察生物过程已经广泛应用于肿瘤研究。Hoffman RM指出荧光蛋白给生物学研究带来了革命性的变化,特别是动态观察活体动物肿瘤细胞运动、侵袭、转移及血管的发生以及肿瘤细胞的休眠、增值和凋亡等方面有重要意义。而传统的动物实验方法需要在不同的时间点牺牲实验动物以获得数据, 得到多个时间点的实验结果。相比之下,体内成像通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录,跟踪同一观察目标(标记细胞及基因) 的移动及变化,所得的数据更加真实可信。另外, 这一技术对肿瘤微小转移灶的检测灵敏度极高,不涉及放射性物质, 非常安全。因其操作简单、所得结果直观、灵敏度高等特点, 得到迅速发展,因此用荧光蛋白标记癌细胞, 建立小动物肿瘤模型,在活体荧光成像系统下观察肿瘤生长及转移过程,目前已成为我们研究肿瘤的生物学行为及其特性的一种重要的方法。

  2 GFP和RFP在肿瘤研究中的应用

  2.1 GFP在肿瘤研究中的应用

  绿色荧光蛋白(Green Fluosecent Protein,GFP) 是一种由238 个氨基酸残基组成的单体蛋白, 相对分子质量为2.7 ×104, 最早在海洋腔肠动物水母中发现, 又称水母发光蛋白( aeguorin) ,最大激发波长为395nm,其荧光发射峰为509nm,对于它的研究起步较早,技术也相对成熟。Yang等首先利用整体光学成像系统(whole-body optical imaging system) 对表达GFP 的肿瘤进行实时非侵入性荧光成像,记录了肿瘤转移过程。储军等建立了GFP 标记人肺癌细胞系SPC2A1的腹腔注射自发转移模型和尾静脉注射实验转移模型,模拟了胃肠道肿瘤的腹腔转移和远处转移,并对模型动物进行实时非侵入记录了腹腔肿瘤生长和转移过程。Nakanishi和Mochizuki建立了GFP

  标记胃癌细胞的腹腔自发转移模型,并利用此模型分析和研究了胃癌腹腔转移过程,评价了胃癌的腹腔化疗效果。目前肺癌、前列腺癌、黑色素瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌和脑癌的原位GFP 肿瘤的整体荧光成像模型已建立。在膀胱肿瘤研究方面,国外,Jain-Hua Zhou等将表达绿色荧光蛋白的人类浅表膀胱癌KU-7细胞通过膀胱灌注法原位种植于裸小鼠,并应用活体荧光成像系统动态观察肿瘤的生长过程;在国内,谭万龙等采用阳离子脂质体介导的基因转染的方法用绿色荧光蛋白标记的人膀胱肿瘤T24 细胞建立了可视裸鼠原位移植模型。

  2.2 RFP在肿瘤研究中的应用

  1999年,Matz 等在印度洋太平洋地区的珊瑚虫中分离出6种与绿色荧光蛋白同源的荧光蛋白,并鉴定了它们的光谱性质。其中来源于Discosoma sp.红色荧光蛋白在紫外线的照射下可发射红色荧光, DsRed 基因编码的蛋白质由225 个氨基酸组成,相对分子质量为25.9ku,它的一级结构与GFP 的同源性很低,仅为23 %;与GFP相比,RFP的激发和发射波长较长,最大激发波长为558nm,最大发射波长为583nm,RFP作为荧光探针的在体光学成像有两个明显的优点:自发荧光少且成像深度深,而且RFP对pH 值不敏感,pH值为4.5~12时仍保持稳定, 在体实验还表明RFP荧光效率大于GFP,使得RFP成为在体荧光成像的理想荧光探针,近些年通过对其修饰,得到了聚集程度低、成熟速率更快、发光强度更强和发射波长更长的RFP突变株,它被称之为“Katushka”,是目前已知最亮荧光蛋白,它的发射波长超过620nm,其发射峰位于培养基、组织培养器材及细胞成分等产生的荧光背景范围之外。Yang M等建立了用活体成像系统实时观察的表达红色荧光蛋白的原位移植前列腺癌动物模型,并认为红色荧光蛋白有高的敏感性和分辨率。Katz MH等建立了表达红色荧光蛋白的原位胰腺癌裸鼠模型,用活体成像系统来对化疗药物的疗效进行动态的临床前评估。

  2.3 GFP和RFP联合在肿瘤研究中的应用

  当前有人同时将GFP和RFP标记应用到肿瘤病理过程的研究,获得双色荧光,从而动态观察到了肿瘤亚细胞动力学变化。Jiang P等分别将GFP和RFP标记到同一癌细胞核和细胞质中,肿瘤细胞表达双色荧光通过活体成像系统来动态观察亚细胞动力学变化(即细胞核和细胞质之间的物质交换)。Yang 等将RFP 标记的黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞和结肠癌细胞移植到系统性表达GFP的转基因小鼠上,在荧光显微镜下观察肿瘤与间质的相互作用,尤其是肿瘤诱导的血管生成和肿瘤浸润的淋巴细胞。由于表达GFP的新生和成熟的肿瘤血管与表达RFP 的肿瘤细胞之间区别显著,可以清楚地观察到表达GFP的巨噬细胞吞噬表达RFP 的肿瘤细胞,表达GFP的淋巴细胞围绕着表达RFP 的肿瘤细胞。因此,利用双重荧光标记在活体荧光成像系统对移植肿瘤进行实时观察,可以在活体内动态监测肿瘤血管的形成和发展。Hoffman RM等也将GFP和RFP分别标记到了癌细胞的细胞核和细胞质中,通过活体成像系统观察到了癌细胞从血管内向血管外移动的过程及癌细胞的生长发育过程。还将红色荧光蛋白标记的癌细胞种植到GFP 转基因小鼠身上,明确的区分癌细胞和宿主细胞,同时用来观察抗癌药物对肿瘤细胞及宿主自身细胞的作用效应,从而在宏观和微观领域的活体荧光成像得以实现并且用于药物研究。Yamamoto N等将GFP和RFP分别标记到一种有肺转移倾向的纤维肉瘤的两种细胞亚系上,建立肺转移模型,通过图像分析可以定性及定量观察到瘤体中两种细胞的组成。冯娟等把DsRed-Express 和EGFP 基因插入chickenβ2actin 强启动子下游构建转基因载体,建立红色荧光和绿色荧光转基C57BLP6J小鼠模型;高苒等用RFP标记小鼠黑色素瘤细胞接种在GFP转基因小鼠皮下建立了双色荧光标记小鼠B16肿瘤模型,观察到了肿瘤的间质细胞、淋巴细胞和血管的生长等,同时也证实了香菇多糖在肿瘤治疗中的免疫调节作用。

  3 结语

  当前随着聚集程度低、成熟速率更快、发光强度更强和发射波长更长的荧光蛋白突变株的不断被发现,以及荧光成像仪器设备精密度和灵敏度的不断提高,人们对于肿瘤的可视化研究水平已经大大提高,从宏观领域到微观领域均已实现,这将为肿瘤的发展机制研究和最佳治疗策略的选择以及新的抗肿瘤药物的研究提供了更好的手段和工具。

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