最近，有三个研究小组报道指出，改进的蓝色Aequorea荧光蛋白变体与EBFP相比，亮度和光敏感性有明显增强。这些新的变体被命名为Azurite(石青或蓝铜矿)、强力增强型蓝色荧光蛋白2(strongly enhanced blue fluorescent protein 2, SBFP2)及EBFP2，它们第一次使得活细胞在蓝色光谱区域成功地长时间成像成为可能。即使这三种荧光蛋白在高浓度的微环境中表现出很弱的二聚体特性，但是它们能够在与亚细胞定位的靶蛋白融合中有效地发挥作用，并且它们能够很容易地通过滤光片设备与标准的BFP及4', 6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)一起成像。所有这些BFP变体都可以通过A206K突变改造成真正的单体，而且这种突变不会影响它们的特性。更重要的是，亮度最强、光稳定性最强的蓝色荧光蛋白EBFP2，是EGFP在活细胞中FRET的很好的供体。

　　蓝绿光谱区域(约470nm~500nm)一直是原始的Aequorea ECFP衍生物占优势，直到一个单体的水鸭色(又称水鸭蓝，是蓝色与绿色正中的颜色)变体mTFP1出现。这种荧光蛋白亮度更强，具有酸不敏感性，而且光稳定性更强。来源于四聚体软珊瑚蛋白的mTFP1光谱特性与大多数CFP相比，有稍微的红移，所以命名为水鸭色而不是蓝绿色。与其它CFP不同，mTFP1在发色团的第66位氨基酸是酪氨酸而不是通常的色氨酸。酪氨酸代替色氨酸，使得荧光激发光谱宽度从大约60nm降低到更容易操作的30nm，这样就降低了多色实验和FRET实验中的色度亮度干扰效应。当蓝绿色荧光蛋白与黄色或橙色荧光蛋白组合使用时，mTFP1作为一个FRET的供体，就成为除了mECFP和mCerulean(蔚蓝色或天蓝色荧光蛋白)之外的一个极好的选择。虽然说mTFP1需要特殊的滤光片设备来成像，但是用标准的ECFP滤光片设备也能产生合适的信号水平。

　　最近，应用一种更好的点直接突变方法进行ECFP和EYFP单体变体的突变优化，以增强亮度、折叠效率、可溶性及FRET性能。这样就产生了超级蓝绿色和黄色荧光衍生物，它们分别被命名为SCFP和SYFP。在细菌中表达的这两种荧光蛋白明显要比原荧光蛋白亮度更强，但在哺乳动物细胞中表达的亮度却比原荧光蛋白弱两倍。不过，这些高性能的荧光蛋白应该有利于融合标签，能够用来创造新的更先进的且具有更大动态范围的CFP-YFP FRET生物传感器，用来检测代谢、pH变化、Ca2+波动、蛋白质和酶磷酸化及其它细胞内的生物活动。

　　 绿色荧光蛋白

　　在光谱的绿光区(500nm-525nm)已经发现了多种荧光蛋白，而且来源广泛，包括不同种属的Aequorea、桡足类动物、文昌鱼以及珊瑚。然而多数有齐聚反应，即使最好的荧光蛋白与EGFP相比，也没有明显的优点(表6;图22 m-q)。或许目前活细胞成像最好的选择是GFP衍生的Emerald(祖母绿)，它与EGFP的特性相似。Emerald包含F64L和S65T突变，另外还有四个点突变从而改进了折叠、37℃时的突变率以及亮度。虽然Emerald比EGFP更有效，但含有快速光漂白成分，可能在某些环境下其定量成像会受到影响。过去几年，关于GFP最重大的进展是超折叠GFP(图22e)的发现，即使与不溶性蛋白质融合表达仍然可以高效地折叠而且比EGFP和Emerald的亮度更强、耐酸性更好(表6)。然而，需要注意的是，超折叠GFP可能会产生较高的背景干扰，不过它仍能产生亮度较强的荧光。

　　黄色荧光蛋白

　　作为一种光谱型，黄色荧光蛋白已经被开发成亮度最亮及最通用的遗传编码探针。然而最早的变体EYFP虽然仍被广泛应用，但由于其pKa值高、对卤化物敏感，导致EYFP的应用还很不理想。单体形式的变体柠檬黄(mCitrine)和维纳斯(mVenus)是目前应用最多的黄色荧光蛋白探针，但二者都还没有商业化。然而与之相似的，来源于Aequorea被命名为诞生石Topaz(黄玉)的变体可从Invitrogen公司买到。另外，一旦新开发的SYFP在哺乳动物细胞中能够融合表达并得到证实，一定会成为一种有用的黄色荧光蛋白。

　　另一种很有应用潜力的黄色荧光蛋白是能量转移黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein for energy transfer, YPet)，它经合成的DNA重排获得，与荧光激活的细胞分选术结合能够增强FRET中蓝绿色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的配对。YPet是已经开发的亮度最强的黄色荧光蛋白，并且有很好的光稳定性。YPet对酸性环境的耐受性要比mVenus及其它黄色荧光蛋白变体强，这将拓宽这种探针在研究酸性细胞器的生物传感器中的应用。虽然YPet对FRET是最优化的，但仍存在一个很大的疑问，就是YPet具有如此好的特性的原因，或许仅是由于YPet与CyPet的二聚化作用得到增强。

　　橙色荧光蛋白

　　与数以百计的蓝绿色、绿色及黄色光谱型荧光蛋白相比，在橙色和红色波长(约560nm到650nm)光谱区仅仅开发了几种探针。尽管如此，现有的这几种光谱型的蛋白都是从珊瑚中分离得到的，并且在多种成像情景中显现出应用潜力，但在对橙色区域荧光蛋白的命名中存在混乱。通常被命名为红色荧光蛋白RFP的探针如DsRed、TagRFP及tdTomato，实际上具有明显的橙色多于红色的发射谱。不考虑颜色的指示，用标准的四甲基罗丹明异硫氰酸脂(tetramethyl-rhodamine isothiocyanate, TRITC)滤光片设备，橙色光谱型的蛋白在多种颜色，如蓝绿色、绿色和红色情景中更易于成像。

　　Kusabira Orange是来源于香菇珊瑚Fungia concinna的四聚体，它通过cDNA克隆的点特异性突变在蛋白质的N末端添加了10个残基。得到的荧光蛋白在548nm有最大吸收，发射光谱以559nm为中心发出亮的黄-橙色荧光。随后再另外引入20个突变，得到单体形式的mKO。mKO表现出与EGFP相似的亮度，并且在更广泛的荧光发射范围都具有光稳定性，是所有荧光蛋白中最好的，所以它是长期成像实验中的最佳选择。更重要的是，mKO消光系数高，使它成为FRET中蓝绿色和水鸭绿色荧光蛋白的极好受体。现在Kusabira Orange的四聚体和单体变体都已经商业化。

　　最近，研究人员引进了一种新的高亮度的单体橙色蛋白TagRFP，在定位研究和FRET研究中是很有希望的候选物。人们最早是从海葵Entacmaea quadricolor中克隆到其二聚体形式，随后的随机突变产生一种快速成熟变体TurboRFP，其特点是光稳定性高、亮度强、pH耐受性高等。在来自相同种属的相近蛋白(eqFP611)的晶体结构基础上，Merzlyak等在二聚体中替换了几个关键的氨基酸残基，同时进行随机突变以保留蛋白的折叠特性。最终得到的变体TagRFP具有很好的光物理学特性，并且能在哺乳动物细胞中与多种蛋白融合表达。然而，有些实验室发现其光稳定性不如原来描述的那样高。Merzlyak等推测，当GFP和YFP作为供体时，TagRFP将成为极好的FRET受体，但这仍需要进一步验证。

　　通过点特异性和随机突变，人们已经解决了原始Discosoma DsRed荧光蛋白的主要问题。但是要从其它种属的珊瑚虫蛋白构建真正的单体DsRed变体，却是一项困难的任务。要得到第一代单体红色荧光蛋白(mRFP1)，需要改造DsRed序列的33个残基。mRFP1在584nm吸收最大，发射谱607nm。然而，与天然蛋白相比，这种衍生物表现出明显的荧光发射减弱以及很快的光漂白，这导致其比类似的单体GFP和YFP用处要小得多。研究人员利用突变技术来寻找橙色、红色和远红外的荧光蛋白变体，进一步降低这些生物探针的自缔合(self-association，文后小词典)的倾向，同时将发射峰推进到更长的波长区域。

　　在所有光谱型中，亮度最强的荧光蛋白是串联形式的二聚体Tomato(dimeric Tomato, dTomato)。它是一种原始的水果蛋白的橙色衍生物。dTomato来源于一种被命名为dimer2的中间体，这种中间体是在四聚体DsRed蛋白崩解过程中产生的。这种变体包含GFP的N末端和C末端的前后各七个氨基酸残基，这样可以提高与融合蛋白的兼容性并降低潜在的定位假象。串联二聚体包含dTomato的两个拷贝，由12个氨基酸残基的接头链接。由于有一对发色团，导致tdTomato亮度极强并且有得天独厚的光稳定性。tdTomato最大的缺点是分子较大，在某些情况下可能会干扰融合蛋白的折叠。

　　红色荧光蛋白

　　在活细胞及动物全身成像中需要表现较好的红色荧光蛋白，主要是由于在多种颜色成像实验中需要红色探针，另外基于较长的激发波长产生的光毒性较小，可以用来探测较深的生物组织。最新研究进展是，通过mRFP1发色团残基的直接突变产生的新的荧光蛋白，得到的单体荧光蛋白发射峰在560nm～610nm，并以相应的水果名字来命名。

　　这其中mStrawberry和mCherry，发射峰分别为596nm和610nm，亮度分别为EGFP的75%和50%左右。mCherry的光稳定性要远强于mStrawberry，所以长期成为成像实验中mRFP1最好的替代品。这些以水果命名的荧光蛋白单体与mKO和TagRFP共同填补了水母红移荧光蛋白(如YPet)与大量低聚红色珊瑚荧光蛋白间的空白，并且目前已经商业化。虽然，某些荧光蛋白缺乏许多成像实验所需要的亮度和光稳定性，但是它们的存在提示我们，最终可以找到跨越整个可见光谱的亮度高、稳定性强的单体探针。

　　研究人员借助一种新技术迭代体细胞超突变(somatic hypermutation, SMH)，获得了两种新的荧光蛋白，这表明首次获得了真正的远红外基因工程探针(发射波长为625nm及649nm)。其中最有应用潜力的是mPlum，虽然其亮度有限仅为EGFP的10%，但它有极好的光稳定性。mPlum可与蓝绿色、绿色、黄色及橙色荧光蛋白一起应用于多色成像实验中，也可在FRET中与绿色和黄色荧光蛋白如mEmerald、mCitrine配对使用。

　　Chudakov等人在2007年组合应用点特异性突变和随机突变得到了编码TurboRFP变体的库，它包含了发色团周围关键位点的突变。经过筛选及进一步突变，人们最后获得了一种二聚体蛋白，并将其命名为Katushka(发射峰为635nm)。虽然亮度仅为EGFP的三分之二，但Katushka是650-800nm光谱区亮度最强的荧光蛋白，此区域对较深的组织成像非常重要。将Katushka的四个主要突变引入TagRFP，产生的一种单体的远红外蛋白mKate具有相似的光谱特点。研究表明，mKate的光稳定性是个例外，其亮度与mCherry类似，这使得它成为在远红外光谱区成像的定位实验中极好的选择。

　　光学加亮荧光蛋白

　　人们在对荧光蛋白变体复杂的光物理学特性的研究，找到了可被两种方式激活的发色团，它们可从静息态发射荧光(即光激活)或者发生荧光发射带宽的转变(即光转化)。这些蛋白出现后被作为一种新型的探针，在活细胞成像中及对蛋白质动力学的研究中最为理想。理想的光学加亮荧光蛋白应易于光激活或光转化以产生更高水平的对比，以单体形式作为融合标签。这些为相对苛刻的光漂白技术提供了一个温和的选择，如光脱色荧光恢复技术(fluorescence recovery after photo-bleaching, FRAP)和光漂白过程中的荧光损失(fluorescence loss in photobleaching, FLIP)，它们需要强的激光并反复照射，以便从感兴趣的区域完全清除活化的光团。更重要的是新合成的或未转化的荧光蛋白并未对它们产生消极的影响，它们仍然是不可见的或继续发射原有的波长。

　　第一个可光活化的(photoactivatable, PA)光学加亮PA-GFP，就是通过将wtGFP的203位苏氨酸替换为组氨酸(T203H)而产生的只有被激活才发出绿色荧光的变体。用强烈的紫色光(390-415nm)照射，这个变体产生的绿色荧光(发射峰在504nm)提高了100倍，从而可以用来追踪分子亚群动力学。PA-GFP的非活化形式很难被检测到，这或许是它最大的缺陷。然而，这一点对于建立一个较大的光活化动力学范围是至关重要的。在Emerald和超折叠GFP基础上开发的类似荧光蛋白动力学范围被降低，这或许是因为非活化状态下的荧光强度明显要比PA-GFP亮。

　　来源于水母Aequorea coerulescens的一种新蛋白质PS-CFP2，就是在405nm照射下发生光转化从蓝绿色变成绿色荧光的。这种光学加亮的荧光蛋白与PA-GFP有相同的发色团，可能是通过类似的机制进行光活化的。PS-CFP2与PA-GFP相比有一优势，在光转化前会发出有效的蓝绿色荧光，这就更容易追踪和定位。然而PS-CFP2的动力学范围要比PA-GFP低，这种探针在光转化效率上不如绿色到红色光学加亮的荧光蛋白。

　　所有已经报道的绿色到红色光学加亮的荧光蛋白(包括Dendra2、Eos、Kaede和KikGR)，都有一个能发出绿色荧光的来源于三肽HYG 的发色团。用短波长的可见光或长波长的紫外线照射，就会引起酰胺氮和组氨酸残基的α碳原子断开，接下来发色团会连接到组氨酸支链上。这一过程 需要完整蛋白的催化作用，结果荧光发射向着长波长(橙色-红色)漂移。这种包括发色团转变的非常规的化学反应，为开发更好的加亮荧光蛋白提供了很好的基础。

　　遗憾的是，光学加亮的荧光蛋白的全部潜能还远远没有被认识到。在现有的几种光活化探针中，PA-GFP仍然是绿色荧光区最好的选择，而且在动力学范围方面远优于红色变体PA-mRFP1。PS-CFP2是蓝绿到绿色光转化的唯一选择，PS-CFP2虽然以单体形式存在，但其亮度低，而且在成像过程中会因持续的光转化而造成伪像。在绿色到红色类型中，在亮度和转化效率方面表现最好的是Kaede和KikGR。然而二者都是四聚体，在大多数实验中都不能应用。Dendra2是单体变体，或许在感光融合及FRET研究中是最好的选择。但是由于在激光扫描共聚焦成像中，快速光漂白使其亮度不到四聚体的50%。绿色到红色光加亮荧光蛋白Eos的二聚体在亮度及光稳定性方面比Dendra2要好，但体积大两倍。很明显，所有的种类都需要进一步找到更好的荧光蛋白。

　　来源于Pectiniidae(一种石化珊瑚虫)的单体荧光蛋白Dronpa的产生，宣告了新一代专门的开-关可控的可逆光学加亮荧光蛋白的产生。Dronpa是经过定向和随机突变的基因工程改构获得的，表现出非同寻常的光致变色，用两种不同激发波长照射可使其开启或关闭荧光(图23c和图24j-l)。Dronpa在503nm有一个最大吸收峰，在390nm处有一个次峰。主峰归因于去质子化的发色团(阴离子型)，而次峰产生于质子化(中性)形式的发色团。当在488nm照射时，阴离子型的发色团在最大518nm发射，此时，相应的光量子产率较高达到0.85。与此形成鲜明对照的是，中性形态的发色团几乎发不出荧光。Dronpa的光控开关就是去质子化与质子化形态的相互转换。一旦在488nm受到照射，Dronpa就变成质子化形式，荧光减弱变暗即关闭状态，此时390nm吸收峰占优势。在最低照度(405nm)下，能很容易地令其从暗淡状态转换回原来的去质子化状态，发出荧光。2007年，研究人员报道了水鸭绿荧光蛋白前体mTFP0.7类似的行为，从结晶学上描述了其暗状态和荧光状态的转换。

　　目前，人们已经从Anemonia sulcata分离到一种非荧光色素蛋白，开发出另一种光可控加亮荧光蛋白Kindling荧光蛋白(商品名KFP1)。KFP1只有在525nm和580nm间的绿色或黄色光照射下才发出荧光。低亮度的光导致瞬时红色荧光，其最大激发和发射谱分别为580nm和600nm，随着照射的停止而慢慢地衰退，重新恢复到原来非荧光状态。用强烈的蓝光(450-490nm)照射，会立即完全地淬灭红色荧光，这使得荧光标记受到很好的控制。相反，高强度的绿光(约550nm)照射或以中等水平持续照射，结果导致不可逆的光转换，产生强度比非活化蛋白强30倍的荧光。KFP1主要的缺点是其强制性的四聚体，这严重地影响其作为融合标签及其FRET中的应用。

　　荧光蛋白光控机制的研究表明，发色团顺-反异构体是开关过程的关键事件。顺式构象代表荧光形态，而反式异构体为发色团的非荧光或暗状态。这些构象的改变很显然是伴随着发色团各种各样的质子化作用。更重要的是，光诱导的光控可能是发色团平面性及其内部氨基酸支链结构重排的表现。这可能是各种光活化和光控荧光蛋白基本的机制。

　　除了选择性地标记融合蛋白亚群用来研究动力学外，光学加亮荧光蛋白在超分辨率显微镜技术中也是有价值的工具，它打破了传统的Abbe衍射屏障。最新建立的方法，如光敏定位显微技术(photoactivated localization microscopy, PALM)和随机光学重建显微法(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)就是很好的例子。这些技术使得研究者能够在更高的分辨率下更快地进行活细胞成像。

　　这些独特的光激活探针、绿色到红色光学加亮荧光蛋白及来源于GFP衍生物和造礁珊瑚蛋白的光控变体，都对解决与聚合及微调光激活及发射谱的问题有积极的作用。将来，随着更先进的光学加亮蛋白工程的发展，其光转化波长将漂移到蓝色和绿色光谱区域，比现在常用的紫外波长对活细胞毒性更小，发射波长漂移到穿过远红外区域的黄色区域，这些都将极大地扩展这类探针的应用潜力。